发布日期：2024-04-21 03:42 点击次数：142
肠说念类器官动作一种模拟肠说念结构和功能的三维培养模子，还是庸碌应用于基因功能盘问、疾病模子构建以及药物筛选等范围。基因抒发调控载体在这些应用中发达着遑急作用加拿大pc28官网网址，简略有用地调控肠说念类器官内方针基因的抒发，从而构建更具特异性的肠说念类器官模子，为领悟肠说念疾病机制过火融合提供新的视角。本期，小恒将重心先容基因抒发载体在其中的操作循序，包括质粒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒。（本文波及肠说念类器官的构建可参考干货《类器官大揭秘—肠说念类器官（2）之小肠类器官和结肠类器官》及相关文件而已，在此不再详备描写）
1. 质粒转染肠说念类器官
电转染和脂质体转染是质粒转染肠说念类器官的两种常用循序。
1.1 电转染：
图1. 质粒电转染肠说念类器官[1]
哄骗顷刻的电场脉冲来加多细胞膜的通透性，使质粒简略参加细胞里面；操作时需在意电场强度和时期的优化，以确保高效转染同期减少对细胞的挫伤。以下为电转染操作设施[1]：
2005年11月27日下午4:00左右，沧州的程先生风尘仆仆来到工作室。
桂花树：桂花树因其芳香而闻名，常被视为高贵和吉祥的象征。在风水学中，桂花树能够聚集阳气，对促进家中学业和事业的进步大有好处。同时，桂花与“贵”谐音，寓意着家中会有贵人相助，是镇宅树的首选之一。
张开剩余88%（1）准备电转染所需拓荒及试剂盒、质粒等。
（2）肠说念类器官构建：取原代组织肠隐窝或通过iPSC/ESC指引肠说念类器官，先在Wnt要求培养基中培养以富集干细胞，再用胰卵白酶消化约10分钟（37℃，时期凭据内容情况调遣），得到单细胞悬液。
（3）转染历程：将单细胞悬液以1000g离心5分钟，弃上清，将千里淀重悬于含有质粒的电转体系中，随后按照所使用的仪器及试剂讲明进行电转要求诞生，操作完成后将细胞在电转溶液中室温孵育15分钟。
（4）持续培养：将电转操作完成的细胞悬液滚动至离心管，1000g离心5分钟采集细胞，重悬于Matrigel 中，然后将其接种到相应的培养容器中，加入要求培养基频频培养即可。
（5）不雅察转染遵守：质粒带有荧光的情况下，可在转染后24-48小时通过荧光初步不雅察转染遵守。
1.2 脂质体转染
图2. 质粒转染肠说念类器官后不同时期的像片[2]
借助东说念主工合成的双层脂质体结构与细胞膜和会，将包裹在里面的质粒带入细胞；使用历程中要眷注脂质体与质粒的比例和孵育时期，尽量幸免细胞毒性。转染操作循序与细胞转染近似[2-3]：
（1）准备脂质体转染试剂、基础培养基、质粒加拿大pc28官网网址。
（2）肠说念类器官构建，得到单细胞悬液（同电转染操作）。
（3）转染历程：将单细胞至于要求性滋长培养基中重悬，接种于相应的培养容器中；按转染试剂操作讲明建立转染体系；将制备好的转染复合物加入细胞中，600g离心1小时，然后37℃培养箱中孵育4小时。
（4）持续培养（同电转法）。
（5）不雅察转染遵守（同电转法）。随后可依据施行需求，添加含抗生素（如嘌呤霉素）的培养基进行筛选。
2. 病毒载体转导肠说念类器官
图3. 病毒载体转导肠说念类器官[4]
慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体（AAV）是当今作念基因抒发载体的三大主力，有着各自的上风和适用范围，从细胞水平到体内施行均可应用。举例慢病毒可将方针基因整合到宿主细胞基因组中，罢了弥远踏实抒发；腺病毒可捎带较大的外源DNA片断，转导遵守高；AAV的免疫原性极低，且具有较高的组织特异性，寥落适用于体内基因转导。对于三大病毒载体的详备先容可翻阅小恒的往期内容。
慢病毒、腺病毒和AAV在肠说念类器官中的转导循序与细胞和体内施行有所不同，而三者的转导操作历程是近似的[4-10]：
（1）备好所需病毒载体（慢病毒/腺病毒/AAV）。
（2）肠说念类器官构建，不管是转导哪种病毒载体，王人需要先培养肠说念类器官，不错是肠隐窝折柳培养，也不错是iPSC分化培养而来。
（3）肠说念类器官惩办与解离：三种病毒转导前均可用PBS冲洗类器官；为了使病毒简略更有用地战斗并参加细胞里面，擢升转导遵守，在转导前一般会将还是酿成的肠说念类器官进行机械解离或用胰卵白酶惩办成单个细胞或小细胞簇。解离后，细胞再经PBS清洗去除杂质，并重悬于用于转导的培养基中，以保证最好转导要求。
（4）病毒转导历程：
将病毒液与细胞混杂：将准备好的病毒颗粒与解离后的细胞混杂，随机还会加入助转剂（如polybrene）来擢升转导遵守。
感染操作：为促进病毒的感染遵守，可选择低速离心的循序。将病毒液与细胞混匀后，室温600g离心1小时，然后在37℃培养箱中持续孵育6小时。
类器官采集：转导完成后，1000g离心5分钟采集类器官，去上清，然后将细胞再行包埋到Matrigel中，接种回多孔板中持续培养。
（5）后续培养与筛选：
实时换液：转导后实时更换极新的类器官滋长培养基，以防守细胞景况。
转导遵守不雅察：通过荧结拜微镜不雅察荧光基因的抒发情况，或qPCR、Western blot等分子生物学时刻检测方针基因的抒发水平，评估转导的生效与否过火后果。
抗生素筛选：若是病毒载体带抗性象征基因（如慢病毒），可在转导2-3天后启动添加相应的接受性抗生素，以筛选出踏实抒发外源基因的肠说念类器官。
图4. 慢病毒转导肠说念类器官后不雅察荧光[5]
以上是对于质粒和病毒载体转染肠说念类器官的一般循序，主要从文件中进行讲究整理，供民众初步了解大要的操作历程。在内容操作历程中，需要凭据不同载体的脾性以及施行需求，优化转染和转导要求，以确保高效的基因传递和抒发，同期尽量减少对细胞的不良影响。下期小恒将持续先容肠说念肿瘤类器官的相关内容，接待握续眷注小恒学术~
参考文件
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[4] Andersson-Rolf A, Fink J, Mustata RC, Koo BK. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. 2014;(90):e51765.
[5] Takahashi Y, Sato S, Kurashima Y, et al. A Refined Culture System for Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Intestinal Epithelial Organoids. Stem Cell Reports. 2018;10(1):314-328.
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